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Caspase-8活性测定试剂盒图片
产品货号:
QN2862
中文名称:
Caspase-8活性测定试剂盒
英文名称:
Caspase-8 Activity colorimetric assay Kit
产品规格:
20T|50T|100T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒适用于检测哺乳动物组织、细胞Caspase-8活性。Caspase-8也称FLICE、MACH 或Mch5,通常以酶原的形式存在,凋亡时被激活,被认为是细胞凋亡转导过程的上游caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的凋亡过程中Caspase-8被激活形成二聚体,进而激活下游Caspase-4,6,9,10。测定原理基于Caspase-8特异水解多肽底物IETD-pNA(Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide),释放的游离硝基苯胺pNA在405nm有最大吸光度。采用可见光光度比色法测定pNA而得到Caspase活性。

试剂盒组成
组分规格(100T)保存
裂解缓冲液20ml4℃
反应缓冲液10 ml4℃
2 mM IETD-pNA 底物0.5 ml-20℃,避光
10 mM pNA 标准品0.2ml-20℃,避光

储存条件:按标签标示分别保存试剂,有效期1年

所需仪器:可见光分光光度计配100μl 比色杯,或酶标仪。最佳波长405nm,也可测OD400~450nm但灵敏度略降。

操作步骤

一、组织细胞准备
Caspase活性测定值低,最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少,其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时,并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时,以检测最佳的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时,单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。最少,单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。
1.裂解样本
  细胞裂解:1000g离心5分钟收集细胞,吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100μl裂解液震荡裂解,冰浴10分钟,再次震荡。
  组织裂解:3~10mg组织加100μl裂解液放入小型玻璃匀浆器,上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。
2.4℃条件下12000g离心10分钟,取上清测定,或-70℃保存。
3.蛋白定量:用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1~3mg/ml,相当于每10μl待测样品含10~30μg蛋白,否则应增加细胞用量。

二、测定pNA标准曲线
1.用反应缓冲液稀释10mM pNA标准品为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μM。设置不加pNA的零管。
2.每一浓度取100μl加入96孔板或100μl比色杯,测定405nm吸光度OD值。
3.每一浓度标准管OD405值为x轴,对应的pNA浓度为y轴,用Excel制作pNA浓度对OD405值的标准曲线。

三、样品测定操作
1.按下表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高,可增加或减少样品。
2.盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37℃反应2小时,肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2,此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜,但酶活性较强时,孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
3.样品管OD405减去空白对照OD405,为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量,并以蛋白浓度校正之。
4.测得的Caspase酶活性表示方法有两种。
a、Caspase活性增加的百分比:100%×实验处理组OD/实验对照组OD,简单而可靠。
b、样品Caspase酶活力单位/mg protein,精确但计算较复杂,参见说明。
  反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)
  
无样品空白对照高酶活性样品低酶活性样品
反应缓冲液(μl)958560
待测样品(μl)-1035
底物(μl)555
总体积(μl)100100100


相关说明
1.Caspase酶活力单位定义:当底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37℃ 1小时水解pNA底物,产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线和样品OD值,可计算出Caspase酶活力单位。
2.除了处理组外,可设置阳性凋亡诱导剂组,阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
相关搜索:Caspase-8活性测定试剂盒Caspase-8 Activity colorimetric assay Kit
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